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Jun 13, 2023

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 260 (2023) Citar este artículo

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La fasciolosis (Fasciola hepatica) y la parafistomosis (Calicophoron daubneyi) son dos infecciones importantes del ganado. Calicophoron daubneyi es la especie de Paramphistomidae predominante en Europa y su prevalencia ha aumentado en los últimos 10 a 15 años. En Italia, la evidencia sugiere que la prevalencia de F. hepatica en rumiantes es baja en la parte sur, pero recientemente se ha informado que C. daubneyi tiene una prevalencia alta en la misma zona. Dada la importancia de herramientas confiables para el diagnóstico de trematodos hepáticos y ruminales en rumiantes, este estudio evaluó el rendimiento diagnóstico de las técnicas Mini-FLOTAC (MF), Flukefinder(R) (FF) y sedimentación (SED) para detectar y cuantificar F. hepatica. y huevos de C. daubneyi utilizando muestras fecales de ganado infectadas de forma natural y con púas.

Brevemente, se enriquecieron artificialmente muestras fecales bovinas negativas con huevos de F. hepatica o C. daubneyi para lograr diferentes niveles de recuento de huevos: 10, 50 y 100 huevos por gramo (EPG) de heces. Además, se seleccionaron diez explotaciones ganaderas infectadas naturalmente del sur de Italia con F. hepatica y/o C. daubneyi. Para cada finca, las muestras se analizaron individualmente solo con la técnica MF y como pools usando las técnicas MF, FF y SED. Se utilizó el análisis bayesiano de clases latentes (LCA) para estimar la sensibilidad y precisión de la intensidad de infección prevista, así como la tasa de infección en las granjas infectadas de forma natural.

El resultado de este estudio mostró que el mayor número de huevos (F. hepatica y C. daubneyi) recuperados se obtuvo con MF, seguido de FF y SED en muestras infectadas enriquecidas a 50 y 100 EPG, mientras que con niveles de infección más bajos de 10 EPG. FF dio los mejores resultados. Además, la sensibilidad de todas las técnicas incluidas en el estudio se estimó en > 90 % en niveles de infección > 20 EPG para huevos de F. hepatica y C. daubneyi. Sin embargo, la MF fue la más precisa de las tres técnicas evaluadas para estimar la intensidad de la infección por trematodos. Sin embargo, las tres técnicas pueden estimar potencialmente con precisión la tasa de infección a nivel de granja.

Se necesita optimización y estandarización de técnicas para mejorar la FEC de los huevos de duela.

Entre los helmintos parásitos que pueden transmitir los caracoles de agua dulce (por ejemplo, Galba truncatula), Fasciola hepatica (plataforma hepática) y Calicophoron daubneyi (plataforma ruminal) están ampliamente distribuidos en los países templados. La fasciolosis es altamente endémica principalmente en Europa occidental [1,2,3,4], causando pérdidas de producción con costos significativos de > 3 mil millones de dólares por año para el negocio ganadero mundial [5].

La parafistomosis se considera una enfermedad parasitaria emergente de los rumiantes en Europa [6]. Durante los últimos 20 años, su incidencia y prevalencia han aumentado significativamente en Europa y se han informado muchos brotes de manifestaciones clínicas en diferentes países inducidos principalmente por C. daubneyi, la especie de Paramphistomidae predominante en Europa [7,8,9,10,11 ]. La parafistomosis clínica es causada principalmente por una gran carga de trematodos juveniles en el intestino delgado del huésped infectado, ya que los parásitos adultos, generalmente ubicados en el rumen y el retículo, son bastante bien tolerados [12].

En Italia, la prevalencia de F. hepatica en rumiantes parece ser baja (0,7% a 6,0% en ovinos y 0,9% a 7,8% en bovinos); sin embargo, recientemente se ha informado de una alta prevalencia de C. daubneyi (4,5 a 51,1 % en ovejas y 9,6 a 60,9 % en bovinos) en la misma zona [13,14,15].

El diagnóstico es muy importante para realizar los programas más eficaces de control de fasciolosis y parafistomosis [16].

Los resultados de una encuesta realizada por Hoyle et al. [17] revelaron confusión entre los ganaderos ovinos y/o ganaderos sobre el diagnóstico y control de trematodos, destacando la necesidad de proporcionar asesoramiento sobre mejores prácticas. El diagnóstico y seguimiento de la fasciolosis y la parafistomosis en rumiantes son un desafío. Por lo general, la información sobre la presencia de trematodos hepáticos en una granja proviene de informes de decomiso de hígado [18], que se basan en inspecciones visuales en los mataderos, pero estos procedimientos son variables y potencialmente erróneos porque no están estandarizados [19]. Existen varias pruebas para el diagnóstico ante mortem de trematodos, pero ninguna puede considerarse lo suficientemente sensible y específica para su uso en el campo [20] como "prueba en el corral". Las técnicas basadas en coproantígenos son herramientas prometedoras en el diagnóstico de trematodos; mostraron una sensibilidad del 100% para detectar fasciolosis ovina experimental y brindar información sobre la correlación entre la carga de trematodos y las cantidades de coproantígeno [21]. Sin embargo, las técnicas basadas en ELISA no se pueden utilizar directamente en granjas y no han sido validadas ampliamente en condiciones de campo para confirmar la sensibilidad obtenida en infecciones experimentales [22].

Los recuentos de huevos fecales de trematodos (FEC) son, en cambio, simples y rápidos [19] y también pueden realizarse directamente en la granja, porque no se requieren técnicas de muestreo especializadas ni equipos de laboratorio sofisticados. Los FlukeFEC se utilizan habitualmente en el diagnóstico veterinario de parásitos, con casi un 100% de especificidad, aunque sólo pueden detectar infecciones patentes [20]. No existe una herramienta de diagnóstico estándar para la infección por trematodos, por lo que a menudo se utiliza una combinación de signos clínicos, antecedentes de pastoreo, FEC serológicos, de coproantígeno y trematodos y/o informes del matadero para confirmar las infecciones por trematodos. Se han desarrollado varias variaciones de flukeFEC, utilizando sedimentación simple (SED) [23], sedimentación combinada con flotación [23], sedimentación con filtración fina [24], técnica Flukefinder® (FF) [25] o flotación con (Mini-) Técnicas FLOTAC [1, 26]. Dada la importancia de herramientas confiables para el diagnóstico de trematodos hepáticos y ruminales en rumiantes, este estudio tuvo como objetivo evaluar el rendimiento diagnóstico de las técnicas MF, FF y SED para detectar y cuantificar huevos de F. hepatica y C. daubneyi utilizando heces de ganado infectadas naturalmente. muestras.

Las muestras fecales bovinas negativas se enriquecieron artificialmente con huevos de F. hepatica o C. daubneyi para lograr diferentes niveles de recuento de huevos de 10, 50 o 100 huevos por gramo (EPG) de heces. Las muestras fecales positivas y negativas de F. hepatica y C. daubneyi se recolectaron de bovinos adultos (> 24 meses de edad) en tres granjas ubicadas en la región de Campania (sur de Italia). Se recogieron muestras positivas naturalmente infectadas por uno de los dos trematodos de ganado en pastoreo, mientras que las muestras negativas se recogieron de ganado lechero estabulado sin acceso a pastos.

Para identificar las muestras positivas para potencial extracción de óvulos, así como las muestras negativas para ser infectadas experimentalmente, cada muestra fue analizada en cinco réplicas mediante la técnica básica FLOTAC (sensibilidad = 94% y especificidad = 98%) con un límite de detección de 1 EPG de heces utilizando una solución de flotación de sulfato de zinc (gravedad específica = 1,35) [14, 27]. Los bovinos positivos fueron utilizados como donantes para la extracción de huevos de F. hepatica y C. daubneyi de las heces, utilizando la técnica de recuperación de huevos descrita por Bosco et al. [28] con algunas modificaciones. Brevemente, se emplearon cuatro tamices de diferentes tamaños de malla (1 mm, 250 μm, 212 μm y 63 μm) para separar los huevos de duela de las heces. El tamiz de 63 μm se lavó con agua del grifo para recuperar los huevos y se sedimentó en un vaso de precipitados cónico durante 4 min. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento obtenido fue una suspensión purificada de huevos. El método de extracción se utilizó por separado para los dos trematodos para obtener muestras monoinfectadas. Los huevos purificados obtenidos para cada duela se suspendieron en agua destilada para determinar su concentración calculando la media aritmética del recuento de huevos en diez alícuotas de 10 µl cada una. Se prepararon tres concentraciones de 10, 50 y 100 EPG, añadiendo suspensiones de huevos apropiadas a tres muestras fecales negativas (libres de helmintos) y homogeneizándolas. Se analizaron seis réplicas de cada muestra utilizando los tres métodos (MF, FF y SED) (Fig. 1).

Número de muestras fecales con huevos e infectadas naturalmente (individualmente o en conjunto) analizadas mediante técnicas Mini-FLOTAC (MF), Flukefinder (FF) y sedimentación (SED) para la detección y cuantificación de huevos de Fasciola hepatica y Calicophoron daubneyi

Se seleccionaron diez granjas con ganado vacuno trematodo positivo (infecciones por C. daubneyi y/o F. hepatica) en el sur de Italia. Estas granjas fueron identificadas a partir de la actividad de diagnóstico del Centro Regional de Monitoreo de Infecciones Parasitarias (CREMOPAR, región de Campania, sur de Italia).

En cada granja, se recolectaron muestras fecales individuales directamente del recto de 20 bovinos adultos (> 12 meses). Para cada finca, las muestras se analizaron individualmente solo con la técnica MF y como grupos utilizando también las técnicas FF y SED. Los cuatro grupos de heces (cada uno compuesto por 5 muestras) se realizaron utilizando el protocolo descrito por Rinaldi et al. [29] (Figura 1).

Los tres métodos copromicroscópicos se realizaron tanto para las muestras infectadas como para las infectadas de forma natural, siguiendo las instrucciones del fabricante. El recuento de huevos en heces (FEC; expresado en EPG) se obtuvo utilizando un factor de multiplicación de 5 para MF (0,2 g de heces examinadas = 2 ml de suspensión fecal que contiene 5 g en un volumen total de 50 ml), 0,5 para FF (2 g de heces examinadas) y 0,1 para SED (10 g de heces examinadas) (Tabla 1).

La sensibilidad de las tres técnicas, así como la precisión en la predicción de la intensidad de la infección, se estimaron a partir de muestras fecales enriquecidas con huevos. Primero, se calculó el porcentaje de recuperación de huevos de trematodos para evaluar la precisión de la FEC para cada técnica en cada nivel de conteo de huevos, utilizando la siguiente fórmula: % de recuperación de huevos = 100 – (FEC real – FEC observada)/FEC real × 100 [ 28]. Además, se desarrolló un modelo simple para estimar la sobredispersión de los huevos contados con las diferentes técnicas, asumiendo que el error de medición se distribuye según un binomial negativo (como en Prada et al. [30]), que es una suposición más flexible que utilizando un Poisson, como en Atljia et al. [31]. Como el tamaño de la muestra fecal examinada (en gramos) es diferente en las tres técnicas, la dosis en EPG debe transformarse al número de huevos esperados en la muestra fecal (Tabla 1). El modelo se ejecuta en un marco bayesiano utilizando un paquete de muestreo de Gibbs en R [32], “jags” [33] y “runjags” [34], con un burn in de 1000 (ejecuciones descartadas), extrayendo un total de 10 000 muestras. con un adelgazamiento de 10.

Las simulaciones preliminares (no mostradas) sugirieron que la sobredispersión era la misma en las dos especies de parásitos examinadas; por tanto, se utilizó un único parámetro para cada técnica diagnóstica. Utilizando las distribuciones posteriores de sobredispersión obtenidas del modelo anterior, simulamos 1000 mediciones repetidas en un rango de intensidad real de infección medida en EPG de 1 a 100 (en pasos de 0,5 EPG, 199 000 muestras en total) para los tres diagnósticos. Luego calculamos la sensibilidad (proporción de muestras identificadas correctamente como positivas) y la precisión en la estimación de la intensidad de la infección comparando la verdadera intensidad de la infección con las estimadas mediante los diferentes diagnósticos.

Para estimar la tasa de infección en las granjas infectadas naturalmente, desarrollamos un modelo de análisis de clases latentes (LCA) bayesiano, siguiendo trabajos recientes en otros parásitos [30]. El estado de infección de cada animal individual se estima a partir de los diferentes diagnósticos (tanto MF a nivel individual como su contribución a las muestras agrupadas). A cada individuo infectado se le asignará su intensidad de infección (recuento real de huevos) a partir de una distribución gamma. El modelo estima los parámetros de la distribución gamma de C. daubneyi; sin embargo, para F. hepatica, debido al bajo número de muestras positivas, no se pudo estimar a partir de estos datos, por lo que se calculó a partir de los datos reportados en Rinaldi et al. [1]. Se supone que el número de huevos en cada grupo es el promedio del número real de huevos de los cinco individuos que contribuyen a ese grupo. Se supone que los datos de los diferentes diagnósticos se generan a partir de un sorteo binomial negativo del número real de huevos (en el individuo o en el grupo). El valor de sobredispersión necesario se extrajo de las distribuciones posteriores generadas a partir del modelo anterior para las muestras fecales con huevos. Luego se puede estimar la tasa de infección a nivel de granja y se puede simular la tasa de infección esperada en la granja con FF y SED, que no se recolectaron a nivel individual. Como antes, utilizamos los paquetes “jags” [33] y “runjags” [34] para ejecutar el modelo; Nuevamente descartamos 1000 corridas (burn in), extrayendo un total de 10 000 muestras sin diluir. Todo el código está disponible en: https://github.com/joaquinprada/Fluke-MF-FF-SED-Comparison.

La Tabla 2 informa el resultado de los niveles de EPG de F. hepatica y C. daubneyi utilizando muestras de heces de ganado con huevos en diferentes concentraciones conocidas de EPG (10, 50, 100). Los resultados se expresaron como EPG promedio de las seis réplicas comparando el desempeño de tres técnicas diferentes incluidas en el estudio (MF, FF y SED). La prueba de adición de huevos reveló que todos los métodos fueron capaces de recuperar huevos de F. hepatica y C. daubneyi de las heces de ganado, siendo MF la sensibilidad más baja por debajo de 15 EPG y SED la más baja por encima de 15 EPG (Fig. 2). . Sin embargo, las tres técnicas tuvieron una sensibilidad > 90% en niveles de infección superiores a 20 EPG. Además, al comparar la intensidad de infección real y estimada (en EPG) con los diferentes diagnósticos, la MF fue la técnica que proporcionó la mejor estimación, tanto en términos de exactitud (mediana de EPG estimada) como de precisión (tamaño del intervalo de credibilidad del 95%). (Fig. 3).

Sensibilidad estimada de las tres técnicas de diagnóstico, Mini-FLOTAC (MF), Flukefinder(R) (FF) y sedimentación (SED), en una variedad de intensidades de infección, medida en huevos por gramo (EPG) de heces.

Comparación entre la intensidad de infección real y estimada en huevos por gramo (EPG) de heces. La línea negra diagonal discontinua indica dónde son iguales las EPG verdaderas y estimadas. La mediana de la intensidad de infección estimada está representada por las líneas continuas, mientras que el área sombreada muestra el intervalo de credibilidad del 95 % entre las tres técnicas de diagnóstico, Mini-FLOTAC (MF), Flukefinder(R) (FF) y sedimentación (SED).

Cuando se evalúa la infección natural en diez granjas del sur de Italia, si bien todas las granjas parecen estar infectadas con C. daubneyi con una tasa de infección alta, cuatro parecen ser negativas para F. hepatica o con una tasa de infección baja (Fig. 4). En general, la tasa de infección estimada mediante la técnica de MF a nivel individual es muy similar a la tasa de infección estimada por el modelo, aunque potencialmente subestima la tasa de infección cuando la infección es baja (Fig. 4, lado izquierdo). Los resultados de diagnóstico simulados de FF y SED a nivel individual también arrojan valores de tasa de infección comparables en todas las granjas para ambas especies de parásitos (Fig. 4: rojo oscuro y verde oscuro). Las EPG medias en las muestras agrupadas fueron mayores para MF y FF en comparación con SED (Tabla 3).

Tasa de infección de Fasciola hepatica (izquierda) y Calicophoron daubneyi (derecha) en diez granjas del sur de Italia. La tasa de infección por Mini-FLOTAC se calculó a partir de las muestras a nivel individual (púrpura), mientras que la tasa de infección media por Flukefinder(R) (rojo oscuro) y la sedimentación (verde oscuro) se estimó a partir de los datos simulados a nivel individual. La estimación del modelo, que considera las tres técnicas de diagnóstico y muestras tanto a nivel individual como agrupadas, se muestra en negro. Las barras de error muestran el intervalo de credibilidad del 95%

En este estudio, hasta donde sabemos, se comparó MF por primera vez con FF y SED para la detección de trematodos hepáticos y ruminales en muestras de heces de ganado infectadas de forma natural y enriquecidas. El MF ya fue utilizado con éxito por Malrait et al. [26] para evaluar la presencia de infecciones por duelas ruminales y la FEC de huevos de C. daubneyi, demostrando que era un método confiable, con una sensibilidad y especificidad del 94% y 98%, respectivamente. En nuestro estudio, la técnica MF permitió la recuperación de la mayor cantidad de huevos, seguida de FF y SED para muestras infectadas enriquecidas a 50 y 100 EPG, mientras que el nivel de infección más bajo de 10 EPG FF dio los mejores resultados. Estos hallazgos antes mencionados fueron similares para ambos trematodos. En particular, los porcentajes más altos de recuperación se obtuvieron con MF a 100 EPG, pero los valores recuperados (64,2 % para duelas hepáticas y 70,8 % para duelas ruminales) fueron inferiores a los informados en estudios previos para nematodos gastrointestinales (GIN) en ganado ( 98,1% por Amadesi et al. [35]; 70,9% por Paras et al. [36]), ovinos (100% por Bosco et al. [28] y Godber et al. [37]) y caballos (74,2% por Napravnikova et al. [38]), pero mayor que los huevos de estróngilo equino reportados por Noel et al. [39] (42,6%). Esta diferencia puede explicarse por el hecho de que los huevos de duelas son pesados, mientras que los GIN de rumiantes y caballos son huevos livianos; por lo tanto, el comportamiento en soluciones de flotación y la tasa de recuperación son completamente diferentes [27, 28, 35, 40]. Sin embargo, la SED fue la técnica menos eficiente, recuperando la menor tasa de óvulos. Nuestros resultados concuerdan con un estudio previo sobre la comparación entre las técnicas FF y SED que muestra que la FF fue más eficiente que la simple sedimentación Becker para recuperar huevos de F. hepatica en heces de ovejas y vacas; de hecho, fue capaz de detectar 2 EPG con mayor sensibilidad (100%) ya en niveles bajos de infección [19]. Aunque los métodos de sedimentación (es decir, simples, con filtración fina, seguida de flotación) son los más utilizados para la detección de infecciones por trematodos, su sensibilidad es baja [16, 19]. La sensibilidad estimada para todas las técnicas incluidas en el estudio fue > 90% cuando la intensidad de la infección era > 20 EPG (fig. 2). Sin embargo, a intensidades de infección muy bajas, se estimó que la sensibilidad disminuiría, particularmente para la MF, que tiene un límite de detección de 5 EPG. Los hallazgos obtenidos con MF concuerdan con Zarate-Rendon et al. [41], mostrando que MF y FF dieron mejores resultados que Kato-Katz para FEC de F. hepatica también en humanos, con una sensibilidad del 100% a un nivel de 96 EPG, pero la sensibilidad disminuyó al 40% para MF y al 60%. para FF en el nivel de 14 EPG. En nuestros estudios anteriores en los que se compararon MF y FLOTAC para la detección de huevos de duela, el resultado reveló que FLOTAC tenía una mayor sensibilidad que MF en niveles bajos de infección. El paso de centrifugación en la técnica FLOTAC, que falta en el método MF, ayudó a aumentar el número de huevos de duela detectados [40, 42].

Por otro lado, MF es la más precisa de las tres técnicas para estimar la intensidad de la infección, lo que concuerda con trabajos previos sobre GIN en rumiantes y caballos [28, 35, 43]. Sin embargo, FF y SED pueden sobreestimar y subestimar más la intensidad de la infección, y estos resultados son consistentes en todo el rango de intensidad de la infección evaluado (de 1 a 100 EPG). En otros estudios [35, 44, 45], la precisión mejora cuando aumenta la EPG en la muestra fecal. Sin embargo, es muy importante utilizar herramientas de diagnóstico con un límite de detección bajo y una alta precisión también con niveles bajos de infección, debido a la presencia de sólo unos pocos trematodos (especialmente para F. hepatica y ovejas, que son altamente sensibles a este parásito). puede causar una productividad significativamente reducida [46, 47].

Los hallazgos obtenidos por MF de ganado infectado naturalmente mostraron que las muestras individuales y combinadas no dieron resultados estadísticamente diferentes para las diez granjas analizadas para ambos trematodos, como se demostró anteriormente también para los GIN en rumiantes [29, 42, 48,49,50]. Además, la prevalencia estimada con el modelo, que incluye información de las tres técnicas, se alinea con la tasa de infección medida con MF y la tasa de infección estimada a partir de las técnicas simuladas de FF y SED. Todas las granjas mostraron la presencia de C. daubneyi con una tasa de infección muy alta, mientras que F. hepatica fue más moderada en la mayoría de las granjas, cuatro de las cuales no tuvieron muestras positivas recuperadas, lo que sugeriría que no hay infección (o una tasa de infección relativamente baja). Debido al bajo número de huevos de F. hepatica detectados, se necesitan más estudios, ya que no fue posible evaluar la intensidad de la infección en la región.

Se necesita optimización y estandarización de técnicas para mejorar la FEC de los huevos de duela. La combinación de técnicas FEC sensibles, precisas y estandarizadas con un sistema automatizado confiable permitirá no solo una observación eficiente, sino también una cuantificación de elementos parásitos gracias al uso de un software de inteligencia artificial [51, 52]. La MF es una técnica precisa para estimar la intensidad de la infección en niveles moderados a altos y puede recomendarse en áreas endémicas, por ejemplo para diagnosticar C. daubneyi en el sur de Italia.

Finalmente, podría ser importante realizar más estudios para respaldar decisiones de tratamiento informadas, así como para determinar el umbral de niveles de infección "económicamente relevantes" y evaluar el rendimiento diagnóstico de las diferentes pruebas alrededor de este umbral.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado. Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Mini-FLOTAC

buscador de fluke

Sedimentación

Huevos por gramo

recuento de huevos en heces

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Este artículo se basa en el trabajo del proyecto "Una alianza interdisciplinaria para identificar, PREDECIR y preparar enfermedades emergentes transmitidas por vectores: PREPARE4VBD".

Esta investigación fue conceptualizada y financiada bajo el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No. 101000365.

Departamento de Medicina Veterinaria y Producción Animal, Universidad de Nápoles Federico II, Centro Regional de Monitoreo de Infecciones Parasitarias (CREMOPAR), Nápoles, Italia

Antonio Bosco, Lavinia Ciuca, María Paola Maurelli, Paola Vitiello, Giuseppe Cringoli y Laura Rinaldi

Facultad de Medicina Veterinaria, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Surrey, Guilford, Reino Unido

Joaquin M. Prada

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LR y GC concibieron, diseñaron y coordinaron el estudio. AB, LC, MPM y PV realizaron muestreos y análisis de laboratorio. JMP realizó el análisis de datos bayesiano. AB, LC, JMP y MPM redactaron el manuscrito. LR y GC revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a María Paola Maurelli.

Obtuvimos el consentimiento informado verbal de los propietarios de las granjas para recolectar muestras fecales de los animales.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Bosco, A., Ciuca, L., Maurelli, MP et al. Comparación de Mini-FLOTAC, Flukefinder y técnicas de sedimentación para la detección y cuantificación de huevos de Fasciola hepatica y Calicophoron daubneyi utilizando muestras fecales bovinas infectadas de forma natural y enriquecidas. Vectores de parásitos 16, 260 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05890-2

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Recibido: 28 de marzo de 2023

Aceptado: 19 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05890-2

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